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显微镜的重要光学技术参数

lh91ad 添加于 2015/7/2 10:26:33  568次阅读 | 0次推荐 | 0个评论

显微镜的重要光学技术参数

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学科领域:数理科学 » 物理学 » 光学
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文献笔记

显微镜的重要光学技术

一、显微镜的重要光学技术参数

   在镜检时,人们总是希望能得到清晰而明亮的理想图像,这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准,并且要求在使用时,必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样,才能充分发挥显微镜应有的性能,得到满意的镜检效果。

   显微镜的光学技术参数包括:数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好,它们之间是相互联系又相互制约的,在使用时,应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系。

  1.数值孔径

   数值孔径简写NA,数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数,是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低,的重要标志。其数值的大小,分别明示在物镜和聚光镜的外表面上。

   数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(η)和孔径角(u)半数的正玄之乘积。用公式表示如下:NA=ηsinu/2 孔径角又称“镜口角”,是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大,进入物镜的光通亮就越大,它与物镜的有效直径成正比,与焦点的距离成反比。

   显微镜观察时,若想增大NA值,孔径角是无法增大的,唯一的办法是增大介质的折射率η值。基于这一原理,就产生了水浸系物镜和油浸物镜,因介质的折射率η值大于一,NA值就能大于一。数值孔径最大值为1.4,这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前,有用折射率高的溴萘作介质,溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。这里必须指出,为了充分发挥物镜数值孔径的作用,在观察时,聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值,数值孔径与其它技术参数有着密切的关系,它几乎决定和影响着其它各项技术参数。它与分辨率成正比,与放大率成正比,与焦深成反比,NA值增大,视场宽度与工作距离都会相应地变小。

  2.分辨率

   分辨率又称“鉴别率”,“解像力”。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。显微镜的分辨率用公式表示为:d=0.61λ/NA 式中d为最小分辨距离;λ为光线的波长;NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大,照明光线波长越短,则d值越小,分辨率就越高。

   (1. 要提高分辨率,即减小d值,可采取以下措施。降低波长λ值,使用短波长光源(LEXT3100用408nm激光做光源)。

   (2.曾大介质η值和提高NA值(NA=ηsinu/2)。

   (3.消色差。

   (4.增加明暗反差。

  3.放大率

   放大率就是放大倍数,是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后,人眼所看到的最终图像的大小对原物体大小的比值,是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大率也是显微镜的重要参数,但也不能盲目相信放大率越高越好,在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。

  4.景深

      当显微镜调焦于某一物平面(称之为对准平面)时,如果位于其前和后的物平面仍然能被观察者看清楚的话,则该两平面之间的距离,就称为显微镜的景深。

2dx=250nεˊ/ΓNA

dx是对准平面与同时刚可看清平面之距离,εˊ是弥散斑对眼瞳中心的张角,小于眼睛的极限分辨率,Γ是显微镜的放大倍数,NA是显微镜的数值孔径。由以上公式可看出,显微镜的放大率越高、数值孔径越大,景深越小。。

  

   5.视场直径(Field of view)

    观察显微镜时,所看到的明亮的原形范围叫视场,它的大小,是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度,是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径23最为科学,大视场容易引起场曲。 F=FN/Mob F: 视场直径,FN:视场数,Mob:物镜放大率。视场数(Field Number, 简写为FN),标刻在目镜的镜筒外侧。

   由公式可看出:

   (1.视场直径与视场数成正比。

   (2.增大物镜的倍数,则视场直径减小。因此,若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌,而换成高倍物镜,就只能看到被检物体的很小一部份。

  6.覆盖差

   显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准,光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变,从而产生了像差,这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成像质量。国际上规定,盖玻片的标准厚度为0.17mm, 许可范围在0.16—0.18mm.,在物镜的制造上已将此厚度范围的像差计算在内。物镜外壳上标记0.17,即表明该物镜要求盖玻片的厚度。

  7.工作距离

   工 作距离也叫物距,即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时,被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此,它与焦距是两个概念,平时习惯所说的调焦,实际上是调节工作距离。在物镜数值孔径一定的情况下,工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜,其工作距离小。

普通显微镜由3部分构成,即:①照明系统,包括光源和聚光器;②光学放大系统,由物镜和目镜组成,是显微镜的主体。为了消除像差,目镜和物镜都由几个复杂的透镜组构成;③机械装置,用于固定光学零件和承放试样,方便观察。显微镜所成的像是否清楚不仅决定于放大倍数,还与显微镜的分辨力(resolution)有关,分辨力是指显微镜(或人的眼睛距目标625px处)能分辨物体最小间隔的能力,分辨力的大小决定于光的波长和物镜的数值孔径及介质的折射率。用公式表示为: R=0.61λ /N.A.    N.A.=nsinα/2             式中: n=介质折射率;α=孔径角(标本对物镜孔径的张角),N.A.=数值孔径。孔径角总是要小于180˚,所以sina/2的最大值必然小于1。

   制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,数值孔径一般为0.05~0.95;油镜头用香柏油为介质,数值孔径可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。

 二、激光共聚焦扫描显微镜原理

1.       为什么需要共聚焦显微镜?

  光学显微镜经过了我们伟大的前人们的努力与改良,已经臻于完善的地步。事实上,通常的显微镜可以简单、快捷地为我们提供美丽的微观图像。但是,给这个近乎完善的显微镜世界带来革命性创新的事件发生了,这就是“激光扫描型共聚焦显微镜”的发明。这种新型显微镜的特点是:采用仅将焦点所集中的面上的图像情报提取出来的光学系统,通过改变焦点的同时将所获得的信息在图像存储器内复原,从而可以获得具有完全3维信息情报的鲜明的图像。通过这个方法,可以简单地获得通常的显微镜所无法确认的、关于表面形状的信息。另外,对于通常的光学显微镜来说,“提高分辨率”与“加深焦点深度”是相互矛盾的条件,尤其在高倍率时这个矛盾更为突出,但在共聚焦显微镜来讲,这个难题迎刃而解。

2.       共聚焦光学系统的原理

      共 聚焦光学系统是对样品进行点照明,同时反射光也采用点感受器来受光。样品被放置在焦点位置时,反射光几乎全部可以到达感光器(图中实线),样品偏离焦点时,反射光无法到达感光器(图中点线)。也就是说,共聚焦光学系统中,只有与焦点重合的图象会被输出,光斑、无用的散乱光都被屏蔽掉了。

3.       为何用激光?

      共聚焦光学系统中,对样品进行点照明、同时反射光亦采用点感光器受光。因此,点光源就成为必要。激光属于非常优秀的点光源。大多数情况下,共聚焦显微镜的光源都采用激光光源。另外,激光所具有的单色性、方向性以及优异的光束形状等特征,也是被广泛采用的重要理由。

4.       高速扫描基础上的实时观察成为可能

      激光的扫描,其水平方向采用了声致光偏向单元(Acoustic Optical Deflector,AO素子)、垂直方向采用了伺服电镜(Servo Galvano-mirror)。声致光偏向单元由于不存在机械性震动部分,所以可以进行高速的扫描,在监视画面上实时观察成为可能。这种摄像的高速性,是直接影响聚焦、位置检索速度的非常重要的项目。

5.       焦点位置和亮度的关系

     共聚焦光学系统中,样品被正确地放置在焦点位置时亮度为最大,在它的前后,其亮度皆会锐减(图4实线)。这种焦点面的敏感的选择性,也正是共聚焦显微镜高度方向测定以及焦点深度扩张的原理所在。相对于此,通常的光学显微镜则在焦点位置前后不会有明显的亮度变化(图4点线)。

6.       高对比度、高分辨率

     通常的光学显微镜,由于偏离焦点部分的反射光会发生干扰,它与焦点成像部分发生重叠,从而造成图像对比度的降低。而相对于此,共聚焦光学系统中,焦点以外的散乱光以及物镜内部的散乱光几乎完全被去除掉,因而可以获得对比度非常高的图像。另外,由于光线2次通过物镜使得点像更加先锐化,也提高了显微镜的分辨能力。

7.       光学局部化功能

     共聚焦光学系统中,与焦点重合点以外的部分的反射光被微孔屏蔽掉了。因此在观察立体样品时,形成如同用焦点面对样品进行切片后形成的图象(图5)。这种效果被称为光学局部化,属于共聚焦光学系统的特长之一。

8.       焦点移动记忆机能

     所谓焦点以外的反射光被微孔屏蔽掉,反过来看的话,可以认为共聚焦光学系统所成的像上所有的点均与焦点重合。因此将立体样品沿Z轴(光轴)方向移动的话,将图像累积保存在存储器内,最终就会获得样品全体与焦点重合而形成的图像。以这种方法将焦点深度无限加深的机能称做移动记忆机能。

9.       表面形状测定机能

     焦点移动机能上,追加以面的高度记录回路,就可以对样品的表面形状进行非接触式测定。以此机能为基础,对各画素中最大辉度值形成的Z轴坐标的记录成为可能,并以此情报为依据可以获得样品表面形状相关的情报。

10.   高精度微小尺寸测定机能

     受光单元采用了1维CCD成像传感器,因此可以不受扫描装置扫描倾斜等的影响,从而可以完成高精度的测定。另外,由于同时采用焦点深度可调(加深)的焦点移动记忆机能,从而可以剔除由于焦点偏移而造成的测定误差。

11.   三维图像解析

     使用表面形状测定机能,可以轻松地做出样品表面三维图像。不仅如此,还可以进行多种解析如:表面粗糙度测定、面积、体积、表面积、圆形度、半径、绝对最大长度、周长、重心、断层图像、FFT变换、线幅测定等等。

12.   术语说明

分辨率:用眼可以分辨的最小的两点之间的距离,在显微镜的领域中,通常以下列公式来表达:

              R=k×λ/NA

*     λ:光源波长、N.A.是透镜的数值孔径

上式中系数k在通常的显微镜中一般为0.61。在采用共聚焦光学系统的显微镜中的k,与普通光学显微镜比较会提高30%左右。

焦点深度:在用显微镜观察样品表面时,可以获得沿光轴方向鲜明图像的范围。共焦点显微镜该值特点是,在数值孔径0.95时约为非常浅的0.2μ。利用焦点浅的特征,可以进行高精度的轴向测定。

数值孔径N.A.:所谓数值孔径,在显微镜中是一个决定空间分辨率的重要参数。它由入瞳的半径相对物点的张角θ的正弦,和物体空间的绝对折射率n按下列公式获得:

       NA = n×sinθ

为提高作为共焦点激光显微镜的特长的高平面分辨率、浅焦点的性能,这个NA值要求尽量大一些,通常采用大的入瞳而具有短焦距的物镜使得θ变大,另外,还有采用液浸法加大n值从而提高NA的方法。

扫描(Scanning):由于激光显微镜会将光束集光于与其波长相近的小点上,为了保持一定的视野,必须对光源或样品台进行移动扫描才行。我们的产品采用二氧化碲晶体和Galvano-mirror进行扫描。

激光:激光与其他自然光不同,其光谱窄、几乎是完全的同相位光。因此,激光具有很高的干涉性、形成方向性很强的光束。另外,通过透镜将它集束后,可使全部输出集中到与波长相当的大小面积上。

三、共聚焦显微镜

共焦显微镜是建立在成熟的激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope) 技术基础之上,新开发的比激光共聚焦扫描显微镜更先进的一类显微镜,它和激光共焦显微镜有相同的成象原理,与激光共焦扫描显微镜区别则在于共焦显微镜的照明光源与激光共焦扫描显微镜的照明光源不同,激光共焦扫描显微镜是把激光作为照明光源,而共焦显微镜则根据不同的需要,用不同的光源(主要是白光)作为照 明光源。常用的光源有:氙灯、汞灯等。因此,共焦显微镜除了具有激光扫描共焦显微镜所具有的一切功能之外,还具有激光共聚焦扫描显微镜所不具有的功能,能观察测量在同一视场中存在的 2个反射率差别很大的区域,具有观察试样真实颜色的功能。

   
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